Startseite > Lernen > Knowledge Center > Bestimmung des absoluten Molekulargewichts von HSAs mit dem BeSEC

Bestimmung des absoluten Molekulargewichts von HSAs mit dem BeSEC

2026-01-13Application Note

Zusammenfassung: Humanes Serumalbumin (HSA) wird häufig in biomedizinischen, pharmazeutischen und industriellen Anwendungen eingesetzt, bei denen eine genaue Bestimmung des Molekulargewichts unerlässlich ist. In dieser Studie wurde die Größenausschlusschromatographie (SEC) in Verbindung mit statischer Lichtstreuung und Brechungsindexmessung eingesetzt, um das absolute Molekulargewicht und die Agrregationszustände von HSA zu bestimmen. Dadurch wurde eine zuverlässige Identifizierung und Quantifizierung von monomeren und oligomeren Spezies ermöglicht.

Schlüsselwörter: Humanes Serumalbumin (HSA), Absolutes Molekulargewicht, Proteinaggregation, Größenausschlusschromatographie (SEC), Statische Lichtstreuung, Biopolymercharakterisierung

Produkt	BeSEC
Industrie	Pharmazie, Biologika
Probe	Humanes Serumalbumin (Protein)
Messmethode	Absolutes Molekulargewicht und Proteinaggregationsanalyse
Messtechnologie	Größenausschlusschromatographie (SEC), Statische Lichtstreuung

Einführung

Humanes Serumalbumin (HSA) ist das am häufigsten vorkommende Protein im Plasma und spielt eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung des kolloidosmotischen Drucks und beim Transport einer Vielzahl endogener und exogener Substanzen. Klinisch wird HSA zur Wiederherstellung des Blutvolumens bei Schock oder Verbrennungen, zur Behandlung von Hypoalbuminämie bei Leberzirrhose oder nephrotischem Syndrom eingesetzt und dient aufgrund seiner starken Bindungsfähigkeit als Wirkstoffträger.

In der Forschung wird HSA aufgrund seiner hohen Reinheit und Stabilität weit als Standard verwendet und unterstützt das Zellwachstum als Schlüsselfaktor in Kulturmedien. Über die biomedizinischen Anwendungen hinaus wird HSA in Hautpflegeformulierungen eingesetzt, um die Feuchtigkeitsbindung zu verbessern und die Hautbarriere zu stärken. In Spezialnahrungsmitteln liefert es hochwertiges Protein und trägt zur Emulgierung und Stabilität bei.

Experimenteller Teil

Für diese Studie wurde ein Größenausschlusschromatographie-(SEC)-System verwendet, das mit Detektoren für Brechungsindex (RI) und Lichtstreuung (LS) ausgestattet ist. Der LS-Detektor ist das BeSEC LS2 von Bettersize Instruments und ist mit Messwinkeln von 90°- und 7°-ausgestattet. Die BeSEC-Workstation kombiniert Lichtstreuung mit RI- oder UV-Signalen, um Verteilungen sowie Durchschnittswerte des Molekulargewichts (Mn, Mw und Mz) zu berechnen.

Systemkonfiguration:

Detektoren: Lichtstreuung (LS) + Refraktionsindex (RI)
Säule: Shodex PROTEIN LW-803
Mobile Phase: Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)
Flussrate: 0,7 mL/min
Injektionsvolumen: 100 μL
Säulentemperatur: 40 °C
dn/dc: 0,185 mL/g

Probenvorbereitung:

Zwei HSA-Proben (A und B) wurden gewogen und in PBS zu einer Konzentration von 2–5 mg/ml gelöst. Die Lösungen wurden gerührt, bis sie klar waren, dann durch 0,22-μm-PES-Spritzenfilter in Ampullen filtriert und in den Autosampler geladen.

Ergebnisse und Diskussion

Abbildung 1. Elutionsprofile der Multi-Detektor-Signale für Probe A

Abbildung 2. Elutionsprofil des Molekulargewichts für Probe A

Abbildung 1 zeigt das Elutionsprofil von HSA nach Durchlaufen der SEC-Säule. Es sind mehrere deutliche Peaks zu erkennen, was darauf hindeutet, dass HSA in PBS in verschiedenen aggregierten Zuständen vorliegt. Nach der Basislinienkorrektur und der Festlegung der Integrationsbereiche für die RI- und Lichtstreuungssignale wurde das Molekulargewicht für jeden Peak berechnet. Diese Werte sind in Tabelle 1 zusammengefasst.

Abbildung 2 zeigt das Molekulargewichtsprofil, das aus der vollständigen Signalintegration abgeleitet wurde. Wie erwartet nimmt das Molekulargewicht mit zunehmendem Elutionsvolumen allmählich ab, was mit dem SEC-Trennprinzip übereinstimmt. Innerhalb jedes Peaks bleibt das Molekulargewicht konstant und bildet ein flaches Plateau. Dieses Verhalten spiegelt die enge Molekulargewichtsverteilung jedes oligomeren Aggregatzustands des Proteins wider.

Abbildung 3. Elutionsprofile der Multi-Detektor-Signale für Probe B

Abbildung 4. Elutionsprofil des Molekulargewichts für Probe B

Tabelle 1. Molekulargewichtsergebnisse für Peaks in Probe A und B

Peak	Sample A		Sample B
Peak	Mw (Da)	Area (%)	Mw (Da)	Area (%)
Peak 1	274,459	1.5	271,545	1.7
Peak 2	199,148	4.6	201,826	3.8
Peak 3	138,694	16.5	141,070	14.4
Preak 4	68,516	76.1	68,403	77.3

Aus Tabelle 1 geht hervor, dass Peak 4, der zuletzt eluiert, ein Molekulargewicht von etwa 68 kDa aufweist, was dem theoretischen Wert des HSA-Monomers entspricht. Die Peaks 1 bis 3 lassen sich als einfache Vielfache von Peak 4 interpretieren, was den Dimer-, Trimer- und Tetramer-Spezies entspricht. Die Peakflächenanalyse zeigt, dass das Monomer etwa 77 % des Gesamtproteins in beiden HSA-Proben ausmacht, während ein erheblicher Anteil in aggregierter Form vorliegt.

Schlussfolgerung

Dieses Anwendungsbeispiel veranschaulicht die Verwendung des BeSEC LS2 mit Merssung der Lichtstreuung zur genauen Bestimmung des Molekulargewichts von HSA-Proben. Die Ergebnisse bestätigen, dass die statische Lichtstreuung präzise Molekulargewichtswerte für jeden Elutionspeak über das gesamte Chromatogramm liefert. Diese Messungen ermöglichen eine genaue Identifizierung der Aggregatzustände und unterscheiden eindeutig das monomere HSA von Oligomeren höherer Ordnung.