Inicio > Aprenda > Centro de conocimiento > Investigación de la agregación de anticuerpos y del peso molecular mediante BeSEC

Investigación de la agregación de anticuerpos y del peso molecular mediante BeSEC

2026-01-12Application Note

Resumen: La agregación de anticuerpos monoclonales es un atributo crítico de calidad que afecta la seguridad y la eficacia de los biofármacos. En este estudio, se empleó cromatografía de exclusión por tamaño combinada con dispersión de luz estática y detección por índice de refracción para caracterizar el peso molecular y los estados de agregación de anticuerpos monoclonales, permitiendo la diferenciación y cuantificación precisa de monómeros, dímeros y agregados de orden superior.
Palabras clave: Anticuerpos monoclonales, agregación de anticuerpos, cromatografía de exclusión por tamaño (SEC), dispersión de luz estática, determinación del peso molecular, caracterización biofarmacéutica.

Producto	BeSEC
Industria	Farmacéutica, biológicos
Muestra	Microesferas de alúmina termoexpandibles
Tipo de medición	Análisis de agregación de proteínas y peso molecular
Tecnología de medición	Cromatografía de exclusión por tamaño (SEC)

Introducción

Los anticuerpos monoclonales (mAbs) son proteínas altamente específicas que reconocen y se unen a antígenos presentes en patógenos como virus y bacterias, lo que permite su detección rápida mediante técnicas como ELISA e inmunofluorescencia. Además de su uso en diagnóstico, los mAbs desempeñan un papel clave en oncología al identificar antígenos asociados a tumores y facilitar la detección temprana del cáncer. Como agentes terapéuticos, los anticuerpos monoclonales pueden dirigirse directamente a células tumorales; por ejemplo, el rituximab se une al antígeno CD20 en células de linfoma de células B, activando su eliminación mediada por el sistema inmunitario. Asimismo, los anticuerpos pueden conjugarse con agentes quimioterapéuticos o radionúclidos para formar conjugados anticuerpo-fármaco (ADC), que permiten la liberación dirigida de agentes citotóxicos en células tumorales, minimizando efectos fuera del objetivo.

Durante la formulación, las soluciones de anticuerpos monoclonales suelen contener dímeros, trímeros y agregados de orden superior. Estas especies pueden aumentar la inmunogenicidad tras la administración, lo que supone riesgos para la seguridad. Por ello, la cuantificación precisa de oligómeros y agregados es esencial para el desarrollo de formulaciones, el control de calidad y la caracterización de agregados.

Sección experimental

En este estudio se utilizó un sistema de cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) equipado con detectores de índice de refracción (RI) y dispersión de luz (LS). El detector de dispersión de luz es el BeSEC LS2 de Bettersize Instruments, con ángulos de detección de 90° y 7°. La estación de trabajo BeSEC integra la dispersión de luz con señales de RI o UV para calcular la distribución del peso molecular y los valores promedio, incluidos Mn, Mw y Mz.

Configuración del sistema:

Detectores: Dispersión de luz (LS) + índice de refracción (RI)
Columna: Shodex PROTEIN LW-803
Fase móvil: Solución salina tamponada con fosfato (PBS)
Caudal: 0.7 mL/minv
Volumen de inyección: 100 μL
Column temperature: 40 ℃
dn/dc: 0.185 mL/g

Preparación de la muestra:

Se prepararon tres muestras de anticuerpos monoclonales (A, B y C) para el análisis. Cada muestra se pesó y se disolvió en PBS hasta una concentración de 2–5 mg/mL. Las soluciones se agitaron hasta quedar completamente transparentes y posteriormente se filtraron a través de filtros de jeringa PES de 0.22 μm. Las soluciones filtradas se transfirieron a viales para su inyección en el automuestreador.

Resultados y discusión

Figure 1. Perfiles de elución de las señales de múltiples detectores para la muestra A

Figure 2. Perfil de elución del peso molecular para la muestra A

La Figura 1 muestra los perfiles de elución de las señales de múltiples detectores para la muestra A, mientras que la Figura 2 presenta la correspondiente distribución del peso molecular. Las señales de dispersión de luz a 90° y 7°, junto con la señal de índice de refracción (RI), revelan múltiples picos bien definidos, lo que indica la presencia de diferentes estados de agregación en la muestra.

Se utilizó la integración por picos para calcular el peso molecular de cada especie, cuyos resultados se resumen en la Tabla 1. El gráfico de peso molecular en función del volumen de elución muestra una disminución gradual del peso molecular a medida que aumenta el volumen de elución, en concordancia con el principio de separación de la SEC, donde las especies de mayor tamaño eluyen antes que las de menor tamaño. Cada pico presenta una meseta de peso molecular, lo que refleja la distribución relativamente estrecha del peso molecular de los distintos estados oligoméricos en la muestra proteica.

Table 1. Resultados de peso molecular de los picos en la muestra A

Peak	Mw (Da)	Ratio of Peak n/Peak 1	Area (%)
Peak 1	149776	1	75.8
Peak 2	295157	1.97	17.4
Peak 3	450351	3	3.8

El peso molecular del Pico 1 es aproximadamente 150 kDa, en concordancia con el valor teórico del monómero de un anticuerpo monoclonal. Los Picos 2 y 3 corresponden a múltiplos del Pico 1, lo que indica la presencia de especies diméricas y triméricas. El análisis cuantitativo muestra que el monómero representa el 75.80% de la proteína total, mientras que las especies agregadas superan en conjunto el 5%. En aplicaciones terapéuticas por vía inyectable, estos agregados son motivo de preocupación, ya que pueden aumentar el riesgo de inmunogenicidad y afectar negativamente la seguridad del producto.

Figure 3. Perfiles de elución de las señales de múltiples detectores para la muestra B

Figure 4. Perfil de elución del peso molecular para la muestra B

Figure 5. Perfiles de elución de las señales de múltiples detectores para la muestra C

Figure 6. Perfil de elución del peso molecular para la muestra C

Las Figuras 3 y 4 muestran el cromatograma y el perfil de peso molecular de la muestra B. Además del pico principal, se observa un pico adicional de menor tamaño a un tiempo de elución más temprano, lo que sugiere la presencia de agregados de orden superior.

Las Figuras 5 y 6 ilustran el cromatograma y el perfil de peso molecular de la muestra C, que presenta un único pico dominante, lo que indica una agregación mínima en esta muestra.

Table 2. Resultados de peso molecular de los picos en la muestra B

Peak	Mw (Da)	Ratio of Peak n/Peak 2	Area (%)
Peak 1	298048	1.97	1.34
Peak 2	151546	1	98.6

Table 3. Resultados de peso molecular de los picos en la muestra C

Peak	Mw (Da)	Ratio of Peak n/Peak 2	Area (%)
Peak 1	147709	1	100

La Tabla 2 muestra que la muestra B contiene un dímero además del pico principal correspondiente al monómero. El peso molecular del dímero es aproximadamente el doble del monómero, y su abundancia relativa es baja, del 1.34%, lo que indica una agregación mínima. En contraste, la Tabla 3 muestra que la muestra C presenta únicamente el pico principal, sin oligómeros ni agregados de orden superior detectables. Este perfil refleja una excelente integridad estructural y sugiere que la muestra C es la más estable entre las tres formulaciones analizadas.

Conclusión

En esta nota de aplicación, se empleó el detector BeSEC LS2 para medir el peso molecular de muestras de anticuerpos monoclonales. Los agregados en biofármacos pueden afectar significativamente el rendimiento terapéutico y la seguridad del paciente, ya que los agregados de mayor tamaño pueden desencadenar respuestas inmunitarias. Por lo tanto, comprender el tipo y el nivel de agregados en formulaciones de anticuerpos monoclonales es fundamental. El sistema BeSEC demuestra que la dispersión de luz estática permite diferenciar eficazmente monómeros, dímeros y especies de orden superior, así como cuantificar su contenido. Esta capacidad resulta especialmente valiosa para el desarrollo, la evaluación de estabilidad y el aseguramiento de la calidad de medicamentos biológicos.